Jocul începe cu Chell trezindu-se într-o cameră mică de sticlă care are înăuntru doar un pat, o toaletă și un radio. GLaDOS îi spune că testele vor începe în curând, iar pe unul dintre pereți se deschide un portal portocaliu. Odată ce jucătorul trece prin ea, ea intră în camerele de testare și începe testarea. Există în total 20 de camere de testare, numite Camere de testare.
Testele încep simplu. Chell trebuie să ridice cutii, numite Weighted Storage Cubes (pe scurt Cubes), și să le pună pe butoane, care vor deschide ușa de ieșire din cameră. În acest moment, GLaDOS îi vorbește lui Chell pe post de ghid, o laudă și îi promite tort când testele se vor termina. Aproape de începutul jocului, Chell primește dispozitivul portabil Aperture Science Handheld Portal Device, cunoscut și sub numele de Portal Gun. La început, Portal Gun-ul ei face doar portaluri albastre, iar portalurile portocalii sunt făcute de GLaDOS. Mai târziu, Chell primește pistolul Portal Gun complet și poate face atât portaluri albastre, cât și portocalii.
Testele devin din ce în ce mai periculoase pe măsură ce se avansează în joc. În unele încăperi, pe podea se găsește otravă. În altele, există bile de electricitate numite "High Energy Pellets" care o vor ucide pe Chell dacă le atinge. În timpul acestor teste, GLaDOS devine din ce în ce mai sarcastic, dându-i lui Chell sfaturi inutile, cum ar fi: "Podeaua de aici te va ucide. Încearcă să o eviți". La un moment dat, GLaDOS îi spune lui Chell că o cameră este spartă și că trebuie să treacă în schimb printr-o cameră plină de tunuri santinelă, numite Turrets. Dacă o Turret o vede pe Chell, va trage în ea până când moare. În această cameră se află o cameră ascunsă. În camera ascunsă sunt desene și scrieri pe pereți lăsate de o persoană necunoscută. Scrisul spune lucruri precum "tortul este o minciună" și "ea este mereu cu ochii pe tine", cu o imagine a unei camere. Există mai multe camere ca aceasta în camerele ulterioare.
Într-o altă cameră, Chell trebuie să folosească Cubul de companie ponderat, care arată ca un Cub de depozitare ponderat cu inimi pe el, pentru a rezolva testul. În timpul testului, GLaDOS îi spune lui Chell de mai multe ori că Cubul Companion nu este viu, dar la sfârșitul testului, îi spune lui Chell că trebuie să "ucidă" Cubul Companion pentru a trece la următorul test.
În timpul ultimului test, Chell trebuie să stea pe o platformă în mișcare. La capătul traseului platformei, aceasta o va duce într-o groapă de foc. GLaDOS îi mulțumește lui Chell pentru că a făcut testele. În ultimul moment, Chell își folosește Pistolul Portal pentru a scăpa din capcană. În timp ce încearcă să scape din clădire, Chell este condusă într-o cameră unde îl găsește pe GLaDOS. Chell sparge o minge albă care a căzut din GLaDOS. GLaDOS îi spune că a fost o prostie să o spargă pentru că nu știau ce era, dar GLaDOS își dă seama rapid că era miezul ei de moralitate. Ea îi spune lui Chell că oamenii care lucrau pentru Aperture Science l-au instalat pentru a o face să nu-i mai ucidă cu "Neuro-Toxina mortală". Pentru că Chell l-a stricat, GLaDOS poate folosi din nou Neuro-Toxina. Chell are o limită de timp de 6 minute pentru a o ucide pe GLaDOS înainte ca Neuro-Toxina să o ucidă pe Chell. După ce rupe bucăți din ea și le arde, GLaDOS este distrus și Chell scapă din clădire.
După ce Chell scapă, ea leșină, iar un robot o trage înapoi în clădire. În timpul genericului, GLaDOS cântă un cântec numit "Still Alive", scris de Jonathan Coulton, care spune că, deși Chell a ucis-o, ea este încă în viață.
