Pe 14 aprilie, Lincoln a mers să asiste cu soția sa la o piesă de teatru la Ford's Theatre din Washington, D.C..
În timpul celui de-al treilea act al piesei, în urma unei replici din piesă care a stârnit cel mai mare râs al serii, Lincoln râdea la această replică când a fost împușcat. John Wilkes Booth, un actor cunoscut și spion confederat din Maryland, a intrat în loja prezidențială și a tras un pistol de la mică distanță în ceafă lui Lincoln, rănindu-l mortal. Lincoln și-a pierdut imediat cunoștința, dar a trecut în inconștiență cu râsul și zâmbetul pe buze.[] Katherine M. Evans, o tânără actriță din piesă, care se afla în afara scenei în momentul în care Lincoln a fost împușcat, dar care s-a grăbit să urce pe scenă după ieșirea lui Booth, a declarat: "M-am uitat și l-am văzut pe președintele Lincoln inconștient, cu capul căzut pe piept,cu ochii închiși, dar cu un zâmbet încă pe față". Lincoln a fost transportat peste drum, la Petersen House. A fost așezat în diagonală pe pat, deoarece cadrul său înalt nu ar fi încăput în mod normal pe patul mai mic. A rămas în comă timp de nouă ore. A murit în dimineața următoare. Pe măsură ce murea, respirația sa devenea mai liniștită, iar fața sa mai calmă. Potrivit unor relatări, la ultima sa respirație, în dimineața de după asasinat, a zâmbit larg și apoi a expirat. Istoricii, mai ales autorul Lee Davis, au subliniat aspectul pașnic al lui Lincoln în momentul și după ce a murit: "A fost pentru prima dată în patru ani, probabil, când o expresie pașnică i-a traversat fața". Secretarul adjunct al Trezoreriei în administrația Lincoln, Maunsell Bradhurst Field, a scris: "Nu am văzut niciodată pe fața președintelui o expresie mai genială și mai plăcută". Secretarul președintelui, John Hay, a văzut că "o privire de o pace de nedescris s-a revărsat pe trăsăturile sale uzate".
După ce a fost fugar timp de 12 zile, Booth a fost localizat și găsit la o fermă din Virginia, la 110 km sud de Washington. După ce a refuzat să se predea trupelor Uniunii, Booth a fost ucis de sergentul Boston Corbett la 26 aprilie.
