Evoluție dirijată

Autor: Leandro Alegsa

07-12-2021

Evoluția dirijată (ED) este o metodă utilizată pentru a produce enzime în scopuri industriale sau medicale.

Metoda este ingineria proteinelor, care imită selecția naturală.

Ideea de bază este de a supune o genă la runde repetate de mutații, pentru a crea o bibliotecă de variante. Selecția izolează genele cu funcția dorită. Acestea reprezintă un șablon pentru următoarea rundă.

Acest lucru se poate face in vivo (în celule vii de bacterii sau drojdii) sau in vitro (în soluție sau în micropurtături).

Testarea mai multor mutanți crește șansele de a găsi unul cu proprietățile dorite.

În timpul evoluției in vivo, fiecare celulă (de obicei bacterii sau drojdie) este transformată cu o plasmidă care conține un membru diferit al bibliotecii de variante. Numai gena de interes diferă între celule, toate celelalte gene fiind păstrate la fel.

Celulele exprimă proteina fie în citoplasmă, fie la suprafață, unde funcția acesteia poate fi testată. Acest format are avantajul de a selecta proprietățile într-un mediu celular, ceea ce este util atunci când proteina sau ARN-ul evoluat urmează să fie utilizat în organisme vii.

Atunci când se realizează fără celule, DE utilizează transcripția și traducerea in vitro pentru a produce proteine sau ARN liber în soluție sau în interiorul unor microîncetine artificiale. Acest lucru are avantajul de a permite mai multe condiții (de exemplu, temperatură, solvenți). Se pot exprima proteine care ar fi toxice pentru celule. În plus, experimentele de evoluție in vitro pot genera biblioteci mult mai mari (până la 10 ¹⁵), deoarece ADN-ul din bibliotecă nu trebuie să fie inserat în celule. Acest lucru limitează adesea ceea ce se poate face.

Un exemplu de evoluție dirijată în comparație cu evoluția naturală. Ciclul interior prezintă cele trei etape ale ciclului de evoluție dirijată, cu procesul natural imitat între paranteze. Cercul exterior arată etapele unui experiment tipic. Simbolurile roșii indică variantele funcționale, iar simbolurile palide indică variantele cu funcție redusă.

Asigurarea eredității

Atunci când proteinele funcționale au fost izolate, este necesar ca și genele lor să fie izolate, prin urmare este necesară o legătură genotip-fenotip.

Aceasta poate fi covalentă, în cazul în care gena ARNm este legată de proteină la sfârșitul traducerii prin puromicină.

Alternativ, proteina și gena sa pot fi păstrate împreună sau în picături de emulsie. Secvențele de gene izolate sunt apoi multiplicate prin PCR sau prin bacterii gazdă transformate. Fie cea mai bună secvență unică, fie un grup de secvențe pot fi folosite ca șablon pentru următoarea rundă de mutageneză. Ciclurile repetate de diversificare-selecție-amplificare fac ca variațiile enzimatice să fie adaptate la procesul de selecție.

O proteină exprimată poate fi legată covalent de gena sa (ca în cazul ARNm), în stânga, sau poate fi plasată în același compartiment cu aceasta, în dreapta. În ambele cazuri, gena care codifică proteina este izolată.

Premiul acordat

Inginerul american Frances Arnold a primit Premiul pentru tehnologie al mileniului pentru pionieratul evoluției dirijate.

Întrebări și răspunsuri

Î: Ce este evoluția dirijată?

R: Evoluția dirijată (DE) este o metodă utilizată pentru a produce enzime în scopuri industriale sau medicale. Este o formă de inginerie a proteinelor care imită selecția naturală.

Î: Cum funcționează evoluția dirijată?

R: Evoluția dirijată funcționează prin supunerea unei gene la runde repetate de mutații, creând o bibliotecă de variante. Selecția izolează apoi genele cu funcția dorită, care sunt apoi folosite ca șabloane pentru următoarea rundă.

Î: Unde poate fi realizată evoluția dirijată?

R: Evoluția dirijată poate fi realizată in vivo (în celule vii de bacterii sau drojdie) sau in vitro (libere în soluție sau în microîncetine).

Î: Care sunt avantajele realizării evoluției dirijate in vivo?

R: Realizarea evoluției dirijate in vivo are avantajul de a selecta proprietăți într-un mediu celular, ceea ce este util atunci când proteina sau ARN-ul evoluat urmează să fie utilizat în organisme vii.

Î: Care sunt avantajele evoluției dirijate in vitro?

R: Evoluția dirijată in vitro are avantajul de a permite mai multe condiții (de exemplu, temperatură, solvenți) și poate exprima proteine care ar fi toxice pentru celule. În plus, se pot genera biblioteci mult mai mari, deoarece nu este necesar să se introducă ADN în celule.

Î: Ce limitează ceea ce se poate face în timpul unui experiment in vitro?

R: Limita de mărime a ceea ce se poate face în timpul unui experiment in vitro este adesea determinată de cantitatea de ADN care trebuie introdusă în celule.