Constantin a invitat toți cei 1800 de episcopi ai bisericii creștine (aproximativ 1000 în est și 800 în vest), dar numai 250-320 de episcopi au participat efectiv. Eusebiu din Cezareea a numărat 250, Atanasie din Alexandria a numărat 318, iar Eustatie din Antiohia a numărat 270 (toți trei au fost prezenți la conciliu). Mai târziu, Socrate Scolasticul a înregistrat mai mult de 300, iar Evagrius, Hilarius, Ieronim și Rufinus au înregistrat 318.
Episcopii au beneficiat de călătorii gratuite la consiliu, precum și de cazare. Acești episcopi nu au călătorit singuri; fiecare avea permisiunea de a aduce cu el doi preoți și trei diaconi; astfel, numărul total al participanților ar fi fost de peste 1500. Eusebiu vorbește de o mulțime aproape nenumărată de preoți, diaconi și acoliți însoțitori.
O importanță deosebită a fost acordată acestui conciliu și datorită faptului că persecuția creștinilor tocmai se încheiase prin Edictul de la Milano din februarie 313 al împăraților Constantin și Licinius.
Episcopii orientali formau marea majoritate. Dintre aceștia, primul rang era deținut de cei trei patriarhi: Alexandru al Alexandriei, Eustatie al Antiohiei și Macarie al Ierusalimului. Provinciile vorbitoare de limbă latină au trimis cel puțin cinci reprezentanți: Marcus de Calabria din Italia, Cecilian de Cartagina din Africa, Hosius de Cordoba din Hispania, Nicasius de Dijon din Galia și Domnus de Stridon din provincia Dunării. Papa Silvestru I nu a participat, spunând că era bolnav, dar a fost reprezentat de doi preoți.
Atanasie din Alexandria, un tânăr diacon și tovarăș al episcopului Alexandru din Alexandria, se număra printre asistenți. Atanasie și-a petrecut în cele din urmă cea mai mare parte a vieții sale luptând împotriva arianismului. Alexandru de Constantinopol, pe atunci presbiter, a fost, de asemenea, prezent ca reprezentant al episcopului său în vârstă.