După câțiva ani în care a lucrat ca inspector de căi ferate împreună cu fratele său, viața lui Wallace s-a schimbat odată cu întâlnirea cu Henry Walter Bates în Leicester, în 1847.
Amazonul
Wallace și Bates au discutat ideea unei expediții în Amazon. Planul era de a acoperi cheltuielile prin trimiterea de specimene înapoi la Londra, unde un agent le-ar fi vândut în schimbul unui comision. De asemenea, călătorii urmau să "adune fapte în vederea rezolvării problemei originii speciilor", după cum spunea Wallace într-o scrisoare către Bates. Cei doi prieteni, care erau deja entomologi amatori experimentați, s-au întâlnit la Londra pentru a se pregăti prin vizionarea plantelor și animalelor sud-americane din principalele colecții.
Bates și Wallace au plecat din Liverpool în aprilie 1848, ajungând în Pará (astăzi Belém) la sfârșitul lunii mai. În primul an s-au stabilit într-o vilă din apropierea orașului, unde au colectat păsări și insecte. După aceea, au convenit să colecteze independent.
Wallace a continuat să cartografieze Amazonul timp de patru ani, colectând specimene și luând notițe despre popoare, limbi, geografie, floră și faună. La 12 iulie 1852, Wallace s-a îmbarcat spre Anglia pe brigada Helen. După douăzeci și opt de zile pe mare, balsamul din încărcătura vasului a luat foc, iar echipajul a fost nevoit să abandoneze nava. Toate specimenele pe care Wallace le avea pe navă, majoritatea colecției sale, au fost pierdute. A putut salva doar o parte din jurnalul său și câteva schițe. Wallace și echipajul au petrecut zece zile într-o barcă deschisă înainte de a fi preluați de brigada Jordeson.
Indiile de Est
Între 1854 și 1862, între 31 și 39 de ani, Wallace a călătorit prin Indiile de Est Olandeze (în prezent Malaezia și Indonezia), pentru a colecta specimene pentru vânzare și pentru a studia natura. Wallace a colectat peste 125.000 de specimene în Indiile Orientale Olandeze (peste 80.000 de gândaci numai în Indiile Orientale Olandeze). Mai mult de o mie dintre ele reprezentau specii noi pentru știință.
Observațiile sale cu privire la diferențele zoologice evidente dintr-o strâmtoare îngustă a arhipelagului l-au determinat să propună granița zoogeografică cunoscută în prezent sub numele de linia Wallace. Bali și Lombok erau două insule din arhipelag aflate la o distanță de numai 17 mile una de alta în cea mai mare lățime (28 km), aproximativ de aceeași mărime și cu același climat, sol, altitudine și aspect. Cu toate acestea, flora și fauna lor erau atât de diferite.
"În acest arhipelag există două faune distincte, rigid delimitate, care diferă la fel de mult ca și cele din Africa și America de Sud... și totuși nu există nimic pe hartă sau pe fața insulelor care să le marcheze limitele. Linia de demarcație trece între insule mai apropiate între ele decât altele aparținând aceluiași grup. Cred că partea vestică este o porțiune separată a Asiei continentale, în timp ce partea estică este o prelungire fragmentară a unui fost continent din vestul Pacificului".
De ce, se întreba el, animalele și plantele de pe partea Bali a canalului erau de tip asiatic, în timp ce cele de pe partea Lombok erau de tip australasian? Acest lucru trebuia să însemne că grupul vestic a evoluat dintr-o tulpină occidentală comună, în timp ce grupul estic a evoluat dintr-o tulpină estică comună.
În timp ce explora arhipelagul, și-a rafinat gândurile despre evoluție și a avut faimoasa idee despre selecția naturală. În 1858, i-a trimis lui Darwin un articol în care își prezenta teoria; acesta a fost publicat, împreună cu o descriere a teoriei lui Darwin, în același an.
Relatările studiilor și aventurilor sale acolo au fost publicate în 1869 sub titlul The Malay Archipelago. A devenit unul dintre cele mai populare jurnale de călătorie de istorie naturală din secolul al XIX-lea. A fost lăudat de Charles Darwin și Charles Lyell, dar și de alții, precum romancierul Joseph Conrad, care l-a numit "tovarășul său preferat de pat".
