În 539 î.Hr., Imperiul neo-babilonian a căzut în fața lui Cyrus cel Mare, regele
Persiei, în bătălia de la Opis. Zidurile Babilonului erau foarte înalte și foarte groase. Singura cale de intrare în oraș era printr-una dintre numeroasele sale porți. Eufratul curgea pe lângă ziduri, iar Cyrus a decis să folosească râul pentru a intra în oraș. Trupele lui Cyrus au deviat râul Eufrat. Acest lucru a făcut ca nivelul râului să scadă, permițând soldaților să intre în oraș.
Babilonienii organizaseră o sărbătoare în acea seară. Armata persană a pus stăpânire pe cea mai mare parte a orașului înainte ca babilonienii să conștientizeze că perșii au intrat în oraș. Relatarea a fost relatată de Herodot și este menționată și în Biblia ebraică. Cyrus a revendicat orașul intrând pe porțile Babilonului, fără să întâmpine rezistență sau cu foarte puțină rezistență din partea babilonienilor beți.
Ulterior, Cyrus a emis un decret prin care permitea oamenilor, inclusiv evreilor, să se întoarcă în țara lor. Acest lucru este menționat în Vechiul Testament. Acesta a permis reconstruirea templului evreilor din Ierusalim.
Sub Cyrus și sub regele persan Darius cel Mare, Babilon a devenit capitala celei de-a 9-a satrapii (Babilonia în sud și Athura în nord). A fost un centru de învățare și de avansare științifică. În Persia Achaemenidă, artele babiloniene ale astronomiei și matematicii au fost revitalizate. Savanții babilonieni au realizat hărți ale constelațiilor. Orașul a fost capitala administrativă a Imperiului Persan. Acest imperiu a fost cel mai puternic din lumea cunoscută atunci. Au fost făcute multe descoperiri arheologice importante care ne îmbunătățesc înțelegerea acelei epoci.
Primii regi persani au încercat să păstreze ceremoniile religioase ale lui Marduk. Până la domnia lui Darius al III-lea, supraimpozitarea și numeroasele războaie au dus la deteriorarea principalelor sanctuare și canale ale Babilonului, precum și la dezintegrarea regiunii. În ciuda a trei rebeliuni în 522 î.Hr., 521 î.Hr. și 482 î.Hr., ținutul și orașul Babilon au rămas sub dominație persană timp de două secole. În 331 î.Hr., Alexandru cel Mare a preluat conducerea. Sub Imperiul Partenian, Babilonul a continuat să se micșoreze și să-și piardă din importanță.