Povestea are loc în momentul în care Spania se apropie de sfârșitul unui război cu Franța. Între cele două țări s-a convenit ca Don Carlos, moștenitorul tronului spaniol, să se căsătorească cu Elisabeta, fiica regelui Franței.
Actul I
Don Carlos vrea să o vadă pe fata cu care urmează să se căsătorească. El merge în Franța și, în secret, se alătură unei vânători regale la care participă Elisabeth. Elisabeth și pajul ei sunt separați de ceilalți. Carlos vorbește cu ea și se oferă să o ducă acasă. Prințesa îl întreabă despre prințul cu care urmează să se căsătorească. Carlos îi spune că nu trebuie să-și facă griji, deoarece prințul este bun și îndrăgostit de ea. Apoi îi arată Elisabetei o fotografie a prințului, iar Elisabeta își dă seama, bineînțeles, că este vorba despre prințul cu care vorbește. Ei cântă un duet de dragoste.
Niște oficiali spanioli vin apoi și îi spun Elisabetei că s-a decis ca ea să nu se căsătorească cu prințul, ci cu tatăl său, regele Spaniei. Cei doi îndrăgostiți sunt consternați de această veste. Mulțimea de oameni o imploră pe Elisabeta să accepte să se căsătorească cu regele Spaniei, pentru ca războiul să înceteze. În cele din urmă, ea acceptă.
Actul II
Don Carlos a plecat la o mănăstire pentru a putea sta liniștit în mizeria lui. Bunicul său, Carol al V-lea, și-a petrecut ultimele zile în această mănăstire. Un călugăr vorbește cu el. Carlos crede că călugărul seamănă cu bunicul său.
Carlos este plin de bucurie când vine prietenul său Rodrigue. Tocmai s-a întors din Flandra, unde încă se mai duc multe lupte. Carlos îi mărturisește un secret: este îndrăgostit de Elisabeth, care s-a căsătorit cu tatăl său și care, prin urmare, este regina Spaniei. Rodrigue îi spune că ar trebui să-și petreacă timpul ajutându-i pe săracii din Flandra. Regele și regina trec pe lângă mormânt.
Când regina părăsește biserica, se duce în grădină, unde o așteaptă doamnele sale. Un mesager îi înmânează o scrisoare de la mama ei din Paris, dar în același timp îi dă în secret o scrisoare de la Carlos. Rodrigue vorbește în liniște cu Eboli, doamna de companie a reginei, în timp ce regina citește scrisorile. Rodrigue o roagă pe regină să încerce să-l convingă pe rege să-l lase pe Carlos să vorbească cu el. Eboli este îndrăgostită de Carlos. Ea a observat cum Carlos a fost agitat atunci când a fost în prezența reginei și crede că acest lucru se datorează faptului că Carlos o iubește pe ea (Eboli).
Lui Carlos i se oferă șansa de a se întâlni cu Elisabeth în particular. El o întreabă cu calm dacă ar putea să-l convingă pe rege să-l trimită în Flandra. Cu toate acestea, el nu este cu adevărat calm și, în curând, începe să fie supărat pe ea pentru că nu manifestă sentimente de dragoste față de el. Ea îi spune că aceasta este datoria ei acum că este regină. Carlos înțelege, dar este în continuare îndrăgostit de ea. El cade la picioarele ei. O apucă și îi declară dragostea, dar regina se desprinde de el, iar el pleacă în grabă, disperat.
Regii ies din biserică. Este foarte supărat că soția lui a fost lăsată singură. Îi spune doamnei de onoare să plece. Regina o consolează. Apoi ea și doamnele ei pleacă.
Rodrigue îi cere regelui să înceteze să mai lupte cu oamenii din Flandra, care continuă să moară și să moară de foame. Regele spune că nu au fost credincioși și că merită să fie pedepsiți. El îi spune lui Rodrigue că se teme de ceea ce se întâmplă între Elisabeth și Carlos. El îi spune să fie atent la Inchiziție.
Actul III
La palatul din Madrid are loc un bal mascat. Carlos așteaptă în grădina reginei. O doamnă vine în grădină, purtând o mască, la fel ca toți ceilalți. Carlos crede că este regina și îi spune cât de mult o iubește. Când doamna își dă masca jos, își dă seama că este Eboni. Ea îl acuză că o iubește pe Regină. În acel moment vine Rodrigue. El îi spune lui Eboni că Carlos nu se simte bine și nu înțelege despre ce vorbește. Dar Eboni nu se lasă înșelată și plănuiește să le strice relația de dragoste.
Cea de-a doua scenă a actului are loc într-o piață din Madrid. Se pregătește un autodafé. În timpul Inchiziției spaniole, aceasta era o ceremonie în care oricine nu era de acord cu biserica romano-catolică era ars de viu. Călugării intră, urmați de nefericiții care vor fi arși. Oamenii cântă despre gloria Spaniei. Regele Philippe apare și repetă cum va lupta împotriva tuturor celor care sunt dușmani ai Bisericii Romano-Catolice. Șase persoane, printre care și Carlos, apar și se aruncă la picioarele lui, rugându-l să oprească trupele sale de la uciderea flamanzilor. Regele nu vrea să audă de așa ceva. O parte din mulțime îl susține pe rege, dar alții îl imploră să aibă milă. Carlos îi cere apoi tatălui său să-i permită să conducă Flandra în locul său. Regele nu permite acest lucru, deoarece își dă seama că aceasta ar putea fi o ocazie pentru Carlos și pentru flamanzi să se ridice împotriva lui. Carlos este disperat. Își scoate sabia și spune că va salva Flandra. Mulțimea este îngrozită să îl vadă comportându-se astfel în fața regelui. Regele le ordonă soldaților săi să îi ia sabia lui Carlos, dar nimeni nu îl ascultă. În cele din urmă, Rodrigue (care își dă seama că acest lucru va fi rău pentru el) salvează situația cerându-i cu calm sabia lui Carlos. Acesta o predă, iar Rodrigue i-o dă regelui. Călugării procesează mai departe, iar o voce din ceruri promite pace în lumea care va veni.
ActIV
Regele este singur în biserică. Într-o arie minunată, el cântă despre tristețea sa că soția sa nu pare să-l iubească. Intră Marele Inchizitor. Este foarte bătrân și orb. Regele îi povestește despre fiul său și îl întreabă pe Inchizitor dacă Carlos ar trebui iertat sau condamnat la moarte. Inchizitorul îi răspunde că Rodrigue este cel care ar trebui ucis. Regele îndrăznește să nu fie de acord. Inchizitorul îi spune regelui că nu-și dăruiește inima lui Dumnezeu. Inchizitorul pleacă.
Regina se grăbește să intre și îi cere regelui să o ajute să caute un sicriu cu bijuterii care a dispărut din camera ei. Regele îi arată că acesta se află pe masă. El îi spune că trebuie să-l deschidă. Ea face acest lucru. În partea de sus se află un portret al lui Carlos. Regele este foarte furios și o acuză de adulter. Ea leșină. Regele îi cheamă pe Eboli și Rodrigue pentru ajutor. Regelui îi pare rău pentru suspiciunea sa, dar Eboli se simte și mai rău pentru că ea a fost cea care a luat sicriul pentru că era geloasă pe Carlos și Elisabeth. Ea a fost cea care i-a sugerat regelui să se uite în caseta cu bijuterii. Rodrigue simte că nu-și poate salva prietenul decât dacă se oferă să fie ucis în locul lui Carlos. Regele și Rodrigue pleacă. Eboni se aruncă la picioarele reginei, care acum a înviat, și mărturisește că ea însăși este vinovată de adulter pentru că s-a culcat cu regele. Elisabeta rămâne calmă, dar îi spune lui Eboni să plece de lângă ea pentru totdeauna și să trăiască într-o mănăstire de călugărițe. Când Eboni este lăsată singură, își exprimă sentimentele de teribilă mizerie. Înainte de a pleca la mănăstire mai are un singur lucru de făcut: să încerce să-l salveze pe Carlos de la moarte.
A doua scenă a actului îl prezintă pe Carlos în închisoare. Rodrigue vine la el. El știe că în posesia lui au fost găsite scrisori flamande adresate lui Carlos. Cineva intră și îl ucide pe Rodrigue. În timp ce moare, îi spune lui Carlos că regina îl va aștepta a doua zi în fața mănăstirii de călugărițe și îl va vedea pentru ultima oară. El moare.
Uneori, actul IV se încheie aici, dar unele spectacole continuă cu o scenă în care regele încearcă să-i înapoieze sabia fiului său, dar Carlos îl acuză că și-a ucis prietenul. Un grup de oameni, printre care și Eboli, intră în închisoare și strigă la rege să îl elibereze pe Carlos. Inchizitorul apare. Acesta le spune furibund mulțimii că sunt răi să meargă împotriva voinței lui Dumnezeu. El le spune tuturor să îngenuncheze și să se pocăiască.
Actul V
Elisabeta îngenunchează în fața mormântului lui Carol al V-lea. Ea cântă despre tinerețea ei pierdută în Franța (o parte din muzica din actul I revine aici). Ea se roagă pentru pace. Elisabeta și Carlos se întâlnesc apoi pentru ultima dată (al treilea duet al lor din operă) și își doresc vremuri mai fericite. Regele și Inchizitorul s-au ascuns. Ei apar acum și îl înhață pe Carlos. Gărzile sunt instruite să îl prindă, dar Carlos se apără. Dintr-o dată se aude vocea lui Carol al V-lea (sau a unui călugăr deghizat). Acesta își duce nepotul în siguranța claustrului.
