Cromatografie în fază gazoasă-spectrometrie de masă

Istoric

Primele lucrări de cercetare privind cromatografia gaz-lichid au fost publicate în 1950. Chimiștii au folosit diferiți detectori pentru a vedea că compușii curgeau de la capătul cromatografului. Majoritatea detectoarelor distrugeau compușii, deoarece îi ardeau sau îi ionizau. Acești detectori îi lăsau pe chimiști să ghicească identitatea exactă a fiecărui compus din probă. În anii 1950, Roland Gohlke și Fred McLafferty au dezvoltat un nou aparat combinat. Ei au folosit un spectrometru de masă ca detector în cromatografia în fază gazoasă. Aceste dispozitive timpurii erau mari, fragile și, inițial, limitate la mediile de laborator.

Proiectul a fost complex. Intervalul de timp dintre diferiți compuși care ies din cromatograf era greu de controlat. Astfel, spectrometrul de masă trebuia să termine de prelucrat un compus înainte ca următorul să iasă din cromatograf. În primele modele, măsurătorile de la spectrometrul de masă erau înregistrate pe hârtie grafică. Chimiștii cu înaltă pregătire studiau modelele de vârfuri pentru a identifica fiecare compus. Prin anii 1970, spectrometrele de masă au fost dotate cu convertoare analog-digitale. Acest lucru a permis calculatoarelor să stocheze și să interpreteze rezultatele. Pe măsură ce computerele au devenit mai rapide și mai mici, GC-MS a devenit mai rapid și s-a răspândit din laboratoare în viața de zi cu zi. În prezent, instrumentele GC-MS computerizate sunt utilizate pe scară largă în monitorizarea mediului în ceea ce privește apa, aerul și solul. De asemenea, este utilizat în reglementarea agriculturii, în siguranța alimentară și în descoperirea și producția de medicamente.

Dezvoltarea calculatoarelor de mici dimensiuni a contribuit la simplificarea aparatelor GC-MS. De asemenea, a redus foarte mult timpul necesar pentru a analiza o probă. Electronic Associates, Inc. (EAI) a fost unul dintre principalii furnizori americani de calculatoare analogice. În 1964, EAI a început dezvoltarea unui spectrometru de masă controlat de calculator sub conducerea lui Robert E. Finnigan. Până în 1966, au fost vândute peste 500 de instrumente de analiză a gazelor. În 1967, a fost înființată Finnigan Instrument Corporation (FIC). La începutul anului 1968, a livrat primele prototipuri de instrumente GC-MS cvadripolare la Stanford și la Universitatea Purdue. FIC a fost redenumită în cele din urmă Finnigan Corporation și a continuat să se impună ca lider mondial în domeniul sistemelor GC-MS.

Operațiune de bază

GC-MS poate găsi toți compușii amestecați împreună într-un obiect de probă. Operatorul dizolvă proba într-un lichid. Operatorul injectează apoi lichidul într-un flux de gaz. (Cel mai adesea se utilizează heliu, hidrogen sau azot gazos.) Gazul curge printr-un tub cu un strat special. Deoarece fiecare compus din eșantion se lipește de înveliș într-un mod diferit, fiecare compus iese din tub la un moment diferit. Astfel, stratul de acoperire este utilizat pentru a separa fiecare compus care a fost amestecat în probă. Pe măsură ce fiecare compus iese la capătul tubului, acesta este ionizat și primește o sarcină electrică. Majoritatea compușilor se despart atunci când sunt ionizați. Diferitele bucăți zboară sub un magnet care separă bucățile în funcție de greutatea și sarcina lor. Un computer măsoară apoi toate bucățile din fiecare compus. Comparând măsurătorile cu o bibliotecă computerizată de compuși cunoscuți, computerul întocmește o listă cu numele tuturor compușilor din eșantion. De asemenea, computerul poate spune cât de mult din fiecare compus se afla în eșantion.

Instrumentație

GC-MS este alcătuit din două componente principale: cromatograful de gaze și spectrometrul de masă. Cromatograful de gaze utilizează o coloană capilară care depinde de dimensiunile coloanei (lungime, diametru, grosimea peliculei), precum și de proprietățile fazei (de exemplu, 5% fenil polisiloxan). Diferența dintre proprietățile chimice dintre diferitele molecule dintr-un amestec va separa moleculele pe măsură ce proba parcurge lungimea coloanei. Moleculele au nevoie de cantități diferite de timp (numit timp de retenție) pentru a ieși (elua din) din cromatograful cu gaz. Acest lucru permite spectrometrului de masă din aval să capteze, să ionizeze, să accelereze, să devieze și să detecteze separat moleculele ionizate. Spectrometrul de masă face acest lucru prin descompunerea fiecărei molecule în fragmente ionizate și detectarea acestor fragmente folosind raportul dintre masa lor și sarcină.

Aceste două aparate, utilizate împreună, permit o precizie mult mai mare a identificării substanțelor decât oricare dintre aceste aparate utilizate separat. Nu este posibil să se facă o identificare precisă a unei anumite molecule doar prin cromatografie în fază gazoasă sau spectrometrie de masă. Procesul de spectrometrie de masă necesită, în mod normal, o probă foarte pură. În trecut, în cromatografia în fază gazoasă se foloseau alte detectoare, cum ar fi detectorul de ionizare a flăcării. Aceste detectoare nu pot separa molecule diferite care se întâmplă să aibă nevoie de același timp pentru a parcurge coloana. (Atunci când două molecule diferite au același timp de retenție, se spune că ele "coeluează"). Moleculele care se co-eluzionează vor confunda programele de calculator care citesc un singur spectru de masă pentru ambele molecule.

Uneori, două molecule diferite pot avea, de asemenea, un model similar de fragmente ionizate într-un spectrometru de masă (spectru de masă). Combinarea celor două procese reduce posibilitatea de eroare. Este extrem de puțin probabil ca două molecule diferite să se comporte în același mod atât într-un cromatograf cu gaz, cât și într-un spectrometru de masă. Prin urmare, dacă un spectru de masă se potrivește cu analitul de interes, timpul de retenție al acelui spectru poate fi comparat cu un timp de retenție caracteristic GC pentru a crește încrederea că analitul se află în probă.

Tipuri de detectoare pentru spectrometrul de masă

Cel mai frecvent tip de SM asociat cu un GC este spectrometrul de masă cuadripolar. Hewlett-Packard (în prezent Agilent) îl comercializează sub denumirea comercială "Detector selectiv de masă" (MSD). Un alt detector relativ comun este spectrometrul de masă cu capcană de ioni. În plus, se poate găsi un spectrometru de masă cu sector magnetic. Cu toate acestea, aceste instrumente particulare sunt scumpe și voluminoase și nu se găsesc de obicei în laboratoarele de servicii de mare capacitate. Se folosesc și alte detectoare, cum ar fi time of flight (TOF), tandem quadrupoli (MS-MS) (a se vedea mai jos) sau, în cazul unui MS cu capcană de ioni ⁿ. Litera n indică numărul etapelor de spectrometrie de masă.

Partea interioară a GC-MS, cu coloana cromatografului de gaze în cuptorul din dreapta.


Schema GC-MS

Analiză

Un spectrometru de masă este utilizat de obicei în două moduri: Scanare completă sau monitorizare selectivă a ionilor (SIM). GC-MS-ul tipic poate funcționa în oricare dintre aceste moduri sau în ambele în același timp.

Scanare completă MS

Atunci când se colectează date în modul de scanare completă, se selectează un interval țintă de fragmente de masă și se introduce în metoda instrumentului. Un exemplu de gamă largă tipică de fragmente de masă de monitorizat ar fi m/z 50 până la m/z 400. Determinarea intervalului de fragmente de fragmente care trebuie utilizat este în mare măsură stabilită de ceea ce se așteaptă să fie în probă, ținând cont în același timp de solvent și de alte posibile interferențe. Dacă un SM caută fragmente de masă cu un m/z foarte scăzut, acesta poate detecta aerul sau alți factori de interferență posibili. Utilizarea unui interval de scanare mare scade sensibilitatea instrumentului. Aparatul va efectua mai puține scanări pe secundă, deoarece fiecare scanare va dura mai mult timp pentru a detecta o gamă mai largă de fragmente de masă.

Scanarea completă este utilă pentru determinarea compușilor necunoscuți dintr-o probă. Oferă mai multe informații decât SIM atunci când vine vorba de confirmarea sau rezolvarea compușilor dintr-o probă. Majoritatea instrumentelor sunt controlate de un computer care operează un program de calculator numit "metodă de instrument". Metoda instrumentului controlează temperatura în GC, rata de scanare MS și intervalul de dimensiuni ale fragmentelor detectate. Atunci când un chimist elaborează o metodă instrumentală, acesta trimite soluții de testare prin GS-MS în modul de scanare completă. Astfel, se verifică timpul de retenție GC și amprenta fragmentului de masă înainte de a trece la o metodă instrumentală SIM. Instrumentele specializate GC-MS, cum ar fi detectoarele de explozivi, au o metodă instrumentală preîncărcată din fabrică.

Monitorizarea ionilor selectați

În cazul monitorizării ionilor selectați (SIM), metoda instrumentului se concentrează pe anumite fragmente de ioni. Numai acele fragmente de masă sunt detectate de spectrometrul de masă. Avantajele SIM constau în faptul că limita de detecție este mai mică, deoarece instrumentul analizează doar un număr mic de fragmente (de exemplu, trei fragmente) în timpul fiecărei scanări. Pot avea loc mai multe scanări în fiecare secundă. Deoarece sunt monitorizate doar câteva fragmente de masă de interes, interferențele matricei sunt de obicei mai mici. Pentru a crește șansele de a citi corect un rezultat pozitiv, rapoartele ionice ale diferitelor fragmente de masă sunt comparabile cu un standard de referință cunoscut.

Tipuri de ionizare

După ce moleculele parcurg întreaga lungime a coloanei, trec prin linia de transfer și intră în spectrometrul de masă, ele sunt ionizate prin diferite metode. De obicei, se utilizează o singură metodă de ionizare la un moment dat. Odată ce proba este fragmentată, aceasta va fi detectată, de obicei cu ajutorul unei diode multiplicatoare de electroni. Dioda tratează fragmentul de masă ionizat ca pe un semnal electric care este apoi detectat.

Chimiștii selectează o tehnică de ionizare separat de alegerea monitorizării Full Scan sau SIM.

Ionizarea electronilor

Cel mai frecvent tip de ionizare este ionizarea cu electroni (EI). Moleculele intră în SM (sursa este un cuadripol sau capcana de ioni în sine într-un SM cu capcană de ioni) unde sunt lovite de electronii liberi emiși de un filament. Acesta este asemănător filamentului pe care îl găsim într-un bec cu incandescență standard. Electronii lovesc moleculele, determinând fragmentarea moleculei într-un mod caracteristic care poate fi repetat. Această tehnică de "ionizare dură" duce la crearea mai multor fragmente cu un raport masă/încărcare (m/z) scăzut. EI are puține fragmente, sau chiar nici unul, care au o masă apropiată de masa moleculei originale. Chimiștii consideră că ionizarea dură constă în lansarea de electroni în moleculele probei. În schimb, "ionizarea moale" constă în plasarea unei sarcini pe molecula de probă prin lovirea acesteia cu un gaz introdus. Modelul de fragmentare moleculară depinde de energia electronilor aplicată sistemului, de obicei 70 eV (electroni volți). Utilizarea a 70 eV ajută la compararea spectrelor generate de proba de testare cu spectrele cunoscute din bibliotecă. (Spectrele de bibliotecă pot proveni de la un software furnizat de producător sau de la un software dezvoltat de National Institute of Standards (NIST-SUA)). Software-ul caută spectrele din bibliotecă folosind un algoritm de potrivire, cum ar fi Probability Based Matching sau dot-product matching. Multe agenții de standardizare a metodelor controlează acum acești algoritmi și metode pentru a asigura obiectivitatea lor.

Ionizare chimică

În cazul ionizării chimice (IC), în spectrometrul de masă se introduce un gaz reactiv, de obicei metan sau amoniac. Există două tipuri de CI: CI pozitivă sau CI negativă. În ambele cazuri, gazul reactiv va interacționa cu electronii și cu analitul și va provoca o ionizare "moale" a moleculei de interes. O ionizare mai moale fragmentează molecula într-un grad mai mic decât ionizarea dură a EI. Chimiștii preferă CI în locul EI. Acest lucru se datorează faptului că CI produce cel puțin un fragment de masă cu o greutate care este aproape aceeași cu greutatea moleculară a analitului de interes.

Ionizare chimică pozitivă

În cazul ionizării chimice pozitive (PCI), gazul reactiv interacționează cu molecula țintă, cel mai adesea printr-un schimb de protoni. Acest lucru produce speciile de ioni în cantități relativ mari.

Ionizare chimică negativă

În cazul ionizării chimice negative (NCI), gazul reactiv reduce impactul electronilor liberi asupra analitului țintă. Această energie diminuată lasă, de obicei, fragmentul în mare cantitate. (Fragmentele nu se desfac mai departe).

Interpretare

Scopul principal al analizei instrumentale este de a măsura o cantitate de substanță. Acest lucru se realizează prin compararea concentrațiilor relative între masele atomice din spectrul de masă generat. Sunt posibile două tipuri de analiză, comparativă și originală. Analiza comparativă compară în esență spectrul dat cu o bibliotecă de spectre pentru a vedea dacă caracteristicile sale sunt prezente pentru un eșantion cunoscut din bibliotecă. Această analiză este cel mai bine realizată de un computer, deoarece există multe distorsiuni vizuale care pot avea loc din cauza variațiilor de scară. Calculatoarele pot, de asemenea, să coreleze mai multe date (cum ar fi timpii de retenție identificați de GC), pentru a corela mai precis anumite date.

O altă metodă de analiză măsoară vârfurile în raport unul cu celălalt. În această metodă, cel mai înalt vârf este stabilit la 100%. Celelalte vârfuri primesc o valoare egală cu raportul dintre înălțimea vârfului și înălțimea celui mai înalt vârf. Toate valorile peste 3% sunt atribuite. Masa totală a compusului necunoscut este în mod normal indicată de vârful părinte. Valoarea acestui vârf părinte poate fi utilizată pentru a se potrivi cu o formulă chimică care să conțină diferitele elemente care se crede că se află în compus. Modelul izotopic din spectru este unic pentru elementele care au mai mulți izotopi. Prin urmare, poate fi utilizat și pentru a identifica diferitele elemente prezente. Acest lucru indică formula chimică globală a moleculei necunoscute. Deoarece structura unei molecule și legăturile unei molecule se despart în moduri caracteristice, acestea pot fi identificate după diferența dintre masele de vârf. Structura moleculei identificate trebuie să fie în concordanță cu caracteristicile înregistrate de GC-MS. De obicei, această identificare se face automat prin intermediul programelor de calculator care vin împreună cu instrumentul. Aceste programe compară spectrele cu o bibliotecă de compuși cunoscuți care au aceeași listă de elemente care ar putea fi prezente în probă.

O analiză a "spectrului complet" ia în considerare toate "vârfurile" dintr-un spectru. Dar, monitorizarea selectivă a ionilor (SIM) monitorizează doar vârfurile selectate asociate cu o anumită substanță. Chimiștii presupun că, la un anumit timp de retenție, un set de ioni este caracteristic unui anumit compus. SIM este o analiză rapidă și eficientă. SIM funcționează cel mai bine atunci când analistul are informații anterioare despre o probă sau caută doar câteva substanțe specifice. Atunci când cantitatea de informații colectate despre ionii dintr-un anumit vârf gaz-cromatografic scade, crește sensibilitatea analizei. Astfel, analiza SIM permite detectarea și măsurarea unei cantități mai mici de compus. Dar gradul de certitudine cu privire la identitatea compusului respectiv este redus.

GC-tandem MS

Atunci când se adaugă o a doua fază de fragmentare a masei, de exemplu, folosind un al doilea cuadripol într-un instrument cu patrupole, se numește MS în tandem (MS/MS). MS/MS sunt bune la măsurarea nivelurilor scăzute de compuși țintă într-o probă cu o matrice de compuși de fond care nu prezintă interes.

Primul cuadripol (Q1) este conectat cu o celulă de coliziune (q2) și cu un alt cuadripol (Q3). Ambii cuadrupoli pot fi utilizați în modul de scanare sau static, în funcție de tipul de analiză MS/MS utilizat. Tipurile de analiză includ scanarea ionilor produs, scanarea ionilor precursori, monitorizarea reacțiilor selectate (SRM) și scanarea pierderilor neutre. De exemplu: Atunci când Q1 este în modul static (analizând o singură masă, ca în SIM), iar Q3 este în modul de scanare, se obține un așa-numit spectru de ioni produs (numit și "spectru fiică"). Din acest spectru, se poate selecta un ion produs proeminent care poate fi ionul produs pentru ionul precursor ales. Perechea se numește "tranziție" și constituie baza pentru SRM. SRM este extrem de specific și elimină aproape complet fundalul matricei.

Aplicații

Monitorizarea și curățarea mediului

Mulți chimiști consideră că GC-MS este cel mai bun instrument pentru monitorizarea poluanților organici din mediul înconjurător. Costul echipamentelor GC-MS a scăzut foarte mult. În același timp, fiabilitatea GC-MS a crescut. Ambele îmbunătățiri au crescut utilizarea în studiile de mediu. Unii compuși, cum ar fi anumite pesticide și erbicide, nu pot fi identificați prin GS-MS. Aceștia sunt prea asemănători cu alți compuși înrudiți. Dar pentru majoritatea analizelor organice ale probelor de mediu, inclusiv pentru multe clase majore de pesticide, GC-MS este foarte sensibil și eficient.

Criminalistică criminalistică

GC-MS poate analiza particulele dintr-un corp uman pentru a ajuta la stabilirea legăturii dintre un criminal și o infracțiune. Legea acceptă utilizarea GC-MS pentru a analiza resturile de incendiu. De fapt, Societatea Americană pentru Testarea Materialelor (ASTM) are un standard pentru analiza resturilor de incendiu. GCMS/MS este deosebit de util în acest caz, deoarece probele conțin adesea matrici foarte complexe, iar rezultatele, utilizate în instanță, trebuie să fie foarte precise.

Aplicarea legii

GC-MS este utilizat pentru detectarea narcoticelor ilegale și ar putea, în cele din urmă, să înlocuiască câinii de detectare a drogurilor. De asemenea, este utilizat în mod obișnuit în toxicologia medico-legală. Aceasta ajută la găsirea drogurilor și/sau a otrăvurilor în specimene biologice prelevate de la suspecți, victime sau de la un cadavru.

Securitate

După atacurile teroriste din 11 septembrie 2001, sistemele de detectare a explozibililor au devenit parte integrantă a tuturor aeroporturilor din SUA. Aceste sisteme se bazează pe o serie de tehnologii, multe dintre ele bazate pe GC-MS. Există doar trei producători certificați de FAA pentru a furniza aceste sisteme. Primul este Thermo Detection (fostul Thermedics), care produce EGIS, o linie de detectoare de explozibili bazată pe GC-MS. Al doilea este Barringer Technologies, care este acum deținut de Smith's Detection Systems. Al treilea este Ion Track Instruments (parte a General Electric Infrastructure Security Systems).

Analiza produselor alimentare, a băuturilor și a parfumurilor

Alimentele și băuturile conțin o mulțime de compuși aromatici, unii prezenți în mod natural în materiile prime, iar alții care se formează în timpul prelucrării. GC-MS este utilizat pe scară largă pentru analiza acestor compuși care includ esteri, acizi grași, alcooli, aldehide, terpene etc. De asemenea, se utilizează pentru a detecta și măsura contaminanții proveniți din alterare sau falsificare care pot fi dăunători. Contaminanții sunt adesea controlați de agențiile guvernamentale, de exemplu pesticidele.

Astrochimie

Mai multe GC-MS au părăsit pământul. Două au mers pe Marte în cadrul programului Viking. Venera 11 și 12 și Pioneer Venus au analizat atmosfera de pe Venus cu GC-MS. Sonda Huygens din cadrul misiunii Cassini-Huygens a aterizat un GC-MS pe cea mai mare lună a lui Saturn, Titan. Materialul din cometa 67P/Churyumov-Gerasimenko va fi analizat de misiunea Rosetta cu un GC-MS chiral în 2014.

Medicină

GC-MS sunt utilizate în testele de screening pentru nou-născuți. Aceste teste pot depista zeci de boli metabolice congenitale (cunoscute și sub numele de erori congenitale de metabolism). GC-MS poate determina compușii din urină chiar și în cantități foarte mici. Acești compuși nu sunt prezenți în mod normal, dar apar la persoanele care suferă de tulburări metabolice. Aceasta devine o modalitate obișnuită de diagnosticare a IEM pentru un diagnostic mai devreme și începerea tratamentului. Acest lucru duce în cele din urmă la un rezultat mai bun. În prezent, este posibil să se testeze un nou-născut pentru peste 100 de tulburări metabolice genetice printr-un test de urină la naștere bazat pe GC-MS.

În combinație cu marcarea izotopică a compușilor metabolici, GC-MS este utilizat pentru determinarea activității metabolice. Majoritatea aplicațiilor se bazează pe utilizarea ¹³C ca marcare și pe măsurarea rapoartelor ¹³C-¹² C cu un spectrometru de masă cu raport izotopic (IRMS). Un IRMS este un spectrometru de masă cu un detector conceput pentru a măsura câțiva ioni selectați și pentru a returna valori sub formă de rapoarte.